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1、臨床血清、血漿標本丙型肝炎病毒核酸定量檢測作業指導書編 制： 審 核： 批 準： 版 本 號: ESZAQDGF001 編 制： 審 核: 批 準： 發 布： 二XX年X月1. 目的采用PCR技術、實時熒光探針技術，用于臨床血清或血漿標本中的丙型肝炎病毒核酸的定性檢測，適用于丙型肝炎病毒感染的輔助診斷。2. 范圍適用于丙型肝炎病毒核酸定量檢測。3. 職責3.1 操作人員：負責標本制備檢測、儀器操作、報告發送。3.2 專業組組長：負責本組耗材的請購，監督本組標本檢測、儀器操作、報告發送、質控管理等各方面工作。3.3 實驗室主任：負責監督和指導實驗室各方面工作。4. 原理采用熒光PCR技術，以丙型2、肝炎病毒基因編碼區的高度保守區為靶區域，設計特異性引物及熒光探針，進行一步法RT-PCR擴增，并檢測熒光信號，儀器軟件系統自動繪制出實時擴增曲線，根據閾循環值(CT)實現對未知樣本的檢測。另外，本試劑盒帶有內標物質，用于對核酸提取的整個過程進行監控，減少假陰性結果的出現。5. 樣本要求5.1 適用標本類型：血清5.2 標本采集用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2 ml，注入無菌的真空采血管中（未加抗凝劑），室溫（22-25）放置30-60min血標本可自發完全凝集析出血清，或直接使用水平離心機，1500rpm離心5min；吸取上層血清，轉移至1.5ml滅菌離心管。5.3 標本保存和運送所采集的3、標本可立即用于測試或長期保存于-70，也可保存于-20待測，保存期為3個月，標本應避免反復凍融。標本運送采用干冰（或者冰袋）保持低溫，運輸時間不應超過4天。5.4 拒收標本：拒絕重度溶血樣本、肝素抗凝的血漿。6. 儀器和試劑6.1 設備AB7500核酸擴增儀、恒溫金屬浴、生物安全柜、低溫離心機等。6.2 試劑生產廠家：xx大學xx基因股份有限公司產品標準批號：YZB/國 7271-2013最低檢出量：最低檢出量為500 IU/ml試劑各組分見表1：表1 試劑盒組分表組 分 名 稱規 格數 量核酸提取試劑RNA提取液A200 ul/管1RNA提取液B5 ml/瓶2DEPC H2O3 ml/瓶1P4、CR 檢測試劑HCV內標溶液100 ul/管1HCV反應液A270 ul/管1HCV反應液B30 ul/管1質控品陰性質控品200 ul/管1HCV強陽性質控品200 ul/管1HCV臨界陽性質控品200 ul/管17. 操作步驟7.1試劑準備（試劑儲存和準備區）7.1.1 進入試劑準備區，打開通風設備，按照消毒清潔程序擦拭實驗臺面，并在檢驗流程記錄表上做相應記錄。 PCR反應液配制7.1.2.1 取出HCV反應液A、HCV反應液AB，室溫溶化后振蕩混勻，8000rpm離心數秒后使用。取出N個（N = 待測樣本數+ 4個HCV陽性定量標準品+HCV強陽性質控品+HCV臨界陽性質控品+陰性質控品5、+空白孔）PCR反應管，HCV單人份擴增體系配制見表2：表2 PCR反應液配置表組分HCV反應液AHCV反應液B總體積用量/人份27 ul3 ul30 ul將各組分充分混勻，混合好后進行短時離心將管壁上的液體全部離心至管底，之后將30 ul擴增體系分裝到PCR反應管，反應液分裝時盡量避免產生氣泡，蓋緊管蓋，經傳遞窗傳遞到標本制備區。7.1.3 75%乙醇配制：取2.25 ml的DEPC H2O，加入6.75ml的無水乙醇，振蕩混勻，配制成75%乙醇，蓋緊蓋子，經傳遞窗傳遞到標本制備區。7.2 RNA提取（標本制備區）7.2.1 進入標本制備區，從傳遞窗中取出PCR反應管和75%乙醇，放入標本制6、備區冰箱冷藏。7.2.2 從冰箱取出待測樣本、陰性質控品、強陽性質控品、臨界陽性質控品、RNA提取液A、RNA提取液B和內標液，放入生物安全柜內室溫溶解，備用。 打開金屬浴，調節溫度為65，使儀器自動升溫。用鑷子夾取n個1.5 ml滅菌離心管放于安全柜內離心管架上。（n= 待測樣本數+ 3 = 待測樣本數 +HCV強陽性質控品+HCV臨界陽性質控品+陰性質控品） 向離心管中各加入10 ul內標溶液，再分別加入200ul樣本，800 ul RNA提取液B，蓋緊管蓋，振蕩混勻15s以充分混勻，室溫放置5min（每隔1min旋渦振蕩5s，使裂解更充分，處理結束后瞬時離心。） 加入200 ul無水乙醇7、，蓋緊管蓋，漩渦振蕩混勻15s以充分混勻，瞬時離心，再加入20 ul RNA提取液A，漩渦振蕩混勻5s，室溫靜置1min。8000 rpm離心1min，小心吸棄上清。 再加入200 ul RNA提取液B，蓋緊管蓋，充分混勻（用移液槍吹打），室溫下8000 rpm離心1min，小心吸棄上清。 加預冷的75%乙醇400ul充分混勻，8000 rpm離心1min，小心吸棄上清。7.2.9加預冷的75%乙醇400ul充分混勻，8000 rpm離心1min，小心吸棄上清。7.2.10 打開管蓋，放入金屬浴，65干燥5 min，使液體揮發完全。 溫育5min后，用鑷子從金屬浴中取出離心管，加入50 ul 8、DEPC H2O，用移液槍吹打混勻，室溫靜置1min后，8000 rpm離心1min。離心管內的上清液即為病毒核酸溶液，建議立即使用，如需保存，置于-70。7.2.13 取出已分裝好的PCR反應管，向對應編號的PCR管中加入處理好的的樣品（包括待測標本、陰性質控品、強陽性質控品、臨界陽性質控品）上清液各20 ul，空白對照不加模板，蓋緊反應管。8000rpm離心數秒，經傳遞窗移至擴增檢測區。（用移液槍小心吸取上清液，盡量不要碰到底層沉淀。）7.3 PCR擴增（擴增區）7.3.1 從傳遞窗中取出PCR反應管，放入儀器樣品槽內。7.3.2 在“Set up”按對應順序設置空白管、陰性質控品、陽性室9、內質控品、臨界陽性質控品、陽性定量參考品及待測標本，并在“sample name”一欄中設置樣本名稱，探針檢測模式設置：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye1：none；Reporter Dye2：VIC，Quencher Dye2：none；Passive Reference：NONE。具體設置方法參考AB 7500核酸擴增儀標準作業指導書。7.3.3 打開“Run Method”窗口設置循環條件：50 15 min，1個循環；95 5min ，1個循環；94 15s 55 45 s（收集熒光）， 45個循環；7.3.4 保存文件，運行儀器。8. 結果分析8.1 反應10、結束后，操作人員可根據實際情況自行調節Baseline的Start值、End值以及Threshold值。Start值可以在3-15，End值可設在5-20。在Log圖譜窗口設置的Threshold的Value值，使閾值線位于擴增曲線指數期，調整陰性質控品的擴增曲線平直或低于閾值線。點擊Analysis自動獲得分析結果，在Report界面查看結果，記錄樣本數值（C）。8.2 如果反應體系擴增曲線在FAM檢測通道無明顯對數增長期，且在VIC檢測通道有對數增長期，則判定樣品的HCV RNA陰性。8.3 如果反應體系擴增曲線在FAM、VIC檢測通道均有對數增長期且FAM檢測通道CT45；或者擴增曲線在11、FAM檢測通道有對數增長期且CT45 ，在VIC檢測通道無對數增長期，則判定樣品的HCV RNA陽性性。9. 質量控制每次實驗均需檢測陰性質控品、HCV 強陽性質控品、HCV臨界陽性質控品。質控品結果滿足質量控制要求時方可進行檢測結果的判斷。9.1 試劑盒自帶質控（1）陰性質控品：FAM檢測通道擴增曲線無明顯對數增長期，VIC檢測通道擴增曲線有明顯對數增長期。（2）HCV 陽性質控品：FAM檢測通道擴增曲線有明顯對數增長期，且強陽性質控品FAM檢測通道CT30，臨界陽性質控品FAM檢測通道36。（3）陽性定量參考品：增長曲線呈S型曲線，且0.97r1。9.2 室內質控每次實驗應選擇適當的HCV12、 RNA質控品做室內質控。9.3 以上要求（9.1和9.2）需在同一次實驗中同時滿足，否則，本次試驗無效，需從新進行。10. 干擾因素10.1 環境中存在RNase，可降解RNA，導致實驗結果假陰性，因此實驗過程應戴手套，帽子，防止皮屑、毛發等的RNase，實驗用品需高壓滅菌后使用，盡量避免污染。 10.2 臨床標本中內源性抑制物：血紅蛋白、免疫球蛋白、白細胞內乳鐵蛋白、脂類、等都可抑制PCR反應，標本應避免溶血、脂血、黃疸等。10.3 外源性抑制物：肝素抗凝劑、纖維素和硝酸纖維素、手套上的滑石粉、標本容器上的抑制物等，標本應按采集要求采集，操作中應小心謹慎，標本容器及實驗用具應鑒定合格。1013、.4 標本的交叉污染：操作過程中應細心認真，防止交叉污染，盡量使用帶鑒定合格的濾芯吸頭，陰性對照品應與標本一起提取，以及時發現交叉污染。11. 生物參考區間： 1.0102 IU/ml1.0108 IU/ml12. 警示/危急值：HCV RNA檢測無警示/危急值。13. 異常結果處理如遇HCV RNA檢測結果與臨床診斷或資料，或與近期歷史檢測結果不相符合，應及時與臨床醫生聯系、溝通，查找原因并采取措施，于疑問報告發放處理記錄表中記錄處理過程。如需復查，需及時保存標本。14. 臨床意義HCV感染診斷的指標，指導臨床治療。15. 變異的潛在來源標本保存不當或反復凍融，都會影響檢測結果的準確。16.14、 注意事項16.1 實驗過程中必須穿專用工作服、戴手套、口罩、帽子、必要時戴防護眼罩，接觸標本后必須及時更換手套。16.2 陽性質控品和檢測樣本均應視為具有傳染性物質，應避免接觸到皮膚和粘膜。16.3 實驗過程必須嚴格分區操作，各區物品均為專用，不得交叉使用。16.4 樣品的處理操作應在生物安全柜內進行。16.5所用檢測試劑使用前應完全解凍，瞬時離心后使用，應避免反復凍融。16.6 樣本核酸提取后，建議馬上進行下一步實驗，否則請保存于-20待用（24 h）。16.7 操作過程中應防止交叉污染，盡量使用鑒定合格的濾芯吸頭，陰性對照品應與標本一起提取。16.8 加樣時應使樣品完全落入反應液中，不應15、有樣品粘附于管壁上，盡快蓋緊管蓋。上機前注意檢查各反應管是否蓋緊，以免熒光物質泄露污染儀器。16.9 標本制備區所用到的試管、吸頭等需打入盛有消毒劑的容器，并與廢物一起滅菌后方可丟棄。16.10 擴增完畢立即取出反應管，密封在專用塑料袋內，丟棄于指定地點。16.11 實驗中用過的吸頭請直接打入盛有10%次氯酸鈉的廢物缸內，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄。16.12 每次實驗均應有質量控制。16.13 實驗完畢用10%次氯酸或75%酒精處理工作臺和移液槍，然后用紫外線燈照射30 min。17. 記錄保存與丙型肝炎病毒核酸定量相關的使用維護保養要如實詳細記錄，并按要求定期歸檔保存。18. 參考文獻xx大學xx基因丙型肝炎病毒核酸定量檢測（PCR-熒光探針法）試劑盒說明書