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1、新生兒ABO溶血病及抗人球蛋白試驗(yàn)作業(yè)指導(dǎo)書編 制： 審 核： 批 準(zhǔn)： 版 本 號(hào): ESZAQDGF001 編 制： 審 核: 批 準(zhǔn)： 發(fā) 布： 二XX年X月 新生兒ABO溶血病及抗人球蛋白試驗(yàn)作業(yè)指導(dǎo)書1、原理 (Test Principle): 1.1 實(shí)驗(yàn)方法:抗原抗體反應(yīng)的免疫方法. 1.2 新生兒溶血病實(shí)驗(yàn)原理:ABO血型新生兒溶血病是由于母體的IgG型抗A(B)抗體通過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)，與胎兒相應(yīng)抗原的紅細(xì)胞結(jié)合，引起胎兒以溶血為主的病理?yè)p害。多見于O型產(chǎn)婦所生的A型或B型嬰兒，由于母親在懷孕ABO血型不合的胎兒以前就可有高效價(jià)的IgG型抗A(B)，所以ABO血型新生兒溶血病2、多發(fā)生在第一胎。 直接抗人球蛋白原理:直接抗球蛋白試驗(yàn)是檢查體內(nèi)致敏紅細(xì)胞的一種方法，用于檢查紅細(xì)胞是否已被不完全抗體所致敏，如新生兒溶血病(胎兒紅細(xì)胞被母親血型抗體致敏)、溶血性輸血反應(yīng)(輸入的不相和紅細(xì)胞被受血者不完全抗體致敏)、自身免疫性溶血性貧血(患者紅細(xì)胞被自身抗體致敏)以及藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的自身抗體(由甲基多巴類藥物，青霉素等所致) 1(3 間接抗人球蛋白原理:它是一種檢測(cè)血清中不完全血型抗體的方法。即用已知抗原紅細(xì)胞測(cè)定受檢血清中相應(yīng)的不完全抗體，或用已知抗體的抗血清測(cè)定受檢紅細(xì)胞上相應(yīng)抗原。常用血型鑒定，抗體的檢出和鑒定，輸血前交叉配血試驗(yàn)以及其它的特殊研究。 2 、樣本收集和貯存3、(Specimen Collection and Storage): 2.1 采集母親未抗凝全血5ml,父親未抗凝全血2 ml.患嬰抗凝及未抗凝全血5ml.室溫下可保存8小時(shí)，2-4?可保存2周。最好不用臍血,因可以產(chǎn)生直接抗人球蛋白的假陽(yáng)性.采取出生3-7天的新生兒的全血分成1:4兩份,一份抗凝,一份不抗凝,抗凝劑可以用EDTA-NA或肝素抗凝,抗凝劑與全血的比例為4:1,采集后立即送檢,因時(shí)間過2長(zhǎng)時(shí),容易產(chǎn)生直接抗人球蛋白的假陽(yáng)性. 2.2抗人球蛋白試驗(yàn)標(biāo)本采集:采取4-5ML不抗凝全血立即送檢. 2.3標(biāo)本拒收條件:標(biāo)本量不夠,或?yàn)槟氀獦?biāo)本,應(yīng)退單,執(zhí)行退單程序. 3 、試劑(Reag4、ents): 3.1 試劑來源:xx生物有限公司 3.2 批準(zhǔn)文號(hào):xx食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2005第2400053號(hào) 3.3 試劑規(guī)格:xx抗人球試劑:3ml/支, ABO反定型紅細(xì)胞試劑10ml?支x2, 紅STANDARD OPERATION PROCEDURE PAGE 4/8 STANDARD OPERATION PROCEDURE PAGE 4/8 K xx州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心 KM-SOP0302019 xx Kingmed Center for Clinical Labrotory Edition 1.0 細(xì)胞抗體篩檢細(xì)胞3ml?支x3聚凝胺試劑100人份?盒 4、儀器(Instru5、ment):50-200UL定期校準(zhǔn)的加樣槍,37?恒溫水浴箱.56?水浴箱 5、材料(Material):血型鑒定卡,7560玻璃試管 6、操作步驟(operate steps): 6、1 ABO血型及RH血型檢測(cè)略,見ABO血型及RH血型檢測(cè)作業(yè)指導(dǎo)書 6、2 游離試驗(yàn): 6.2(1 取玻璃試管5支，分別編上A、B、O1、O2、O3，每管各加待測(cè)血清100ul，在A 管加A 型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞，在B 管加B 型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞，O 管加篩檢紅細(xì)胞各1滴，混勻。 6.2(2 然后加入4滴低離子介質(zhì)，混勻后室溫放置1分鐘，加入2滴聚凝胺試劑，混勻后放15S后3500轉(zhuǎn)/min離心10秒，若沒有凝聚需查找原6、因，若有凝聚盡可能地倒干上清液，再加入2滴再懸液輕搖試管 6.2(3觀察結(jié)果: 指示紅細(xì)胞 意 義 AB型 ?型 ?型 ?型 型 + 游離的抗A + 游離的抗B 游離的抗A、抗B或抗A、B + + + 游離的ABO系統(tǒng)以外的抗體 + 游離的ABO系統(tǒng)以外的抗體 + 游離的ABO系統(tǒng)以外的抗體 無游離抗體 6(3釋放試驗(yàn): 6(3(1用竹支將細(xì)胞凝塊攪碎，生理鹽水洗滌三次，棄去上清，加8滴生理鹽水，置56?水浴震蕩10min，離心取上清液，即為放散液，用放散液代替6.1的待檢血清進(jìn)行檢測(cè) 6(3(2檢測(cè)結(jié)果判斷同游離試驗(yàn). 6(4 直接抗人球蛋白試驗(yàn): 6(4(1 制備3%Rh(D)陽(yáng)性紅細(xì)胞鹽7、水懸液(IgG抗D致敏)供陽(yáng)性對(duì)照用:取3人O 型紅細(xì)胞，混合，經(jīng)鹽水洗滌后取壓積紅細(xì)胞，加等量抗D血清，置37?水浴致敏STANDARD OPERATION PROCEDURE PAGE 5/8 STANDARD OPERATION PROCEDURE PAGE 5/8 K xx州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心 KM-SOP0302019 xx Kingmed Center for Clinical Labrotory Edition 1.0 60min取出，以生理鹽水洗滌3次后，離心除去上清液，再用鹽水配成3%紅細(xì)胞鹽.水懸液 6(4(2 制備正常人3%D陰性紅細(xì)胞懸液，供陰性對(duì)照用:配制除不用抗D血清8、外，其余按上法配制。 6(4(3 取受檢查紅細(xì)胞，以生理鹽水洗滌3次，末次洗滌后將上層鹽水倒盡，再以濾紙將管口附著的鹽水吸去，再配成3%紅細(xì)胞鹽水懸液。 6(4(4 取上述3%受檢者紅細(xì)胞鹽水懸液1滴，滴入1試管(10mm60mm)內(nèi)，加xx譜抗球蛋白血清2滴混勻。 6(4(5 陽(yáng)性對(duì)照:不完全抗D血清致敏的3%D陽(yáng)性紅細(xì)胞懸液1滴加抗球蛋白血清1滴，混勻。 6(4(6 陰性對(duì)照:正常人3%D陽(yáng)性紅細(xì)胞懸液1滴加抗球蛋白血清1滴，混勻。 6(4(7 受檢者以及陽(yáng)性，陰性對(duì)照管同時(shí)以3000g/min，離心15s，輕輕混合，觀察結(jié)果。 6(4(8 結(jié)果判定:如陽(yáng)性對(duì)照管凝集，陰性對(duì)照管不凝集，受9、檢紅細(xì)胞凝集者為陽(yáng)性，不凝集者為陰性。 7、質(zhì)量控制(Quality Control): 7(1 標(biāo)本采取后立即進(jìn)行試驗(yàn)，延遲試驗(yàn)或中途停止可使抗體從細(xì)胞上放出。 7(2 抗球蛋白血清應(yīng)按說明書使用最適稀釋度，否則，可產(chǎn)生前帶和后帶反應(yīng)，而誤為陰性結(jié)果。 7(3 受檢紅細(xì)胞一定要用鹽水洗滌3次，除去紅細(xì)胞懸液中混雜的血清蛋白，以防止假陰性結(jié)果。 7(4 如果了解在體內(nèi)致敏紅細(xì)胞的免疫球蛋白類型，則可分別以抗IgG、抗IgM或抗單價(jià)抗球蛋白清進(jìn)行試驗(yàn)。 C37(5 紅細(xì)胞上吸附抗體太少，或Coombs陰性自身免疫性溶血性貧血直接抗球蛋白試驗(yàn)可呈假陰性反應(yīng)。 7(6 全凝集或冷疑集血液標(biāo)本及臍血標(biāo)10、本含有Wharton膠，且洗滌不充分，血液標(biāo)本中有很多網(wǎng)織紅細(xì)胞，且抗球蛋白血清中含有抗運(yùn)鐵蛋白時(shí)，都可使紅細(xì)胞產(chǎn)生凝集。 8、 間接抗人球蛋白試驗(yàn): STANDARD OPERATION PROCEDURE PAGE 6/8 STANDARD OPERATION PROCEDURE PAGE 6/8 K xx州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心 KM-SOP0302019 xx Kingmed Center for Clinical Labrotory Edition 1.0 8(1 間接抗球蛋白試驗(yàn)操作步驟表1 間接抗球蛋白試驗(yàn)操作步驟: 反應(yīng)物 受檢管 陽(yáng)性對(duì)照 陰性對(duì)照 血清(已知或受檢) 2滴 5%紅11、細(xì)胞懸液(受檢或已知) 1滴 IgG抗D血清 2滴 AB型血清 2滴 5%D陽(yáng)性紅細(xì)胞懸液 1滴 1滴 混勻，置37?水浴60min用生理鹽水洗滌3次。末次洗滌后，將上清液除盡，并用濾紙將附著于管口的鹽水吸去。每管各留紅細(xì)胞懸液1滴。 8.2 加最適稀釋度抗球蛋白血清1滴，混勻，3000轉(zhuǎn)/min，離心15s，觀察結(jié)果。 8.3 陽(yáng)性對(duì)照管凝集，陰性對(duì)照管不凝集，受檢管出現(xiàn)凝集者為陽(yáng)性，受檢管不出現(xiàn)凝集者為陰性。 注意事項(xiàng):1、紅細(xì)胞洗滌應(yīng)迅速，一開始洗滌就不應(yīng)中途停止。洗滌用鹽水要足量并用力沖入管底，使壓積于管底的紅細(xì)胞松離。切勿用手指堵住管口，顛倒混勻，以防污染來自皮膚的蛋白。 8.4離心12、速度和時(shí)間十分重要，應(yīng)按規(guī)定進(jìn)行。 9、生物安全: 應(yīng)將所有的血標(biāo)本視為傳染性物質(zhì).操作時(shí)應(yīng)帶手套.穿工作服,如有血濺到工作服上應(yīng)立即清洗.更換. 10、結(jié)果解釋:略 11、臨床意義: 直接抗球蛋白試驗(yàn)是檢查體內(nèi)致敏紅細(xì)胞的一種方法，用于檢查紅細(xì)胞是否已被不完全抗體所致敏，如新生兒溶血病(胎兒紅細(xì)胞被母親血型抗體致敏)、溶血性輸血反應(yīng)(輸入的不相和紅細(xì)胞被受血者不完全抗體致敏)、自身免疫性溶血性貧血(患者紅細(xì)胞被自身抗體致敏)以及藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的自身抗體(由甲基多巴類藥物，青霉素等) 11、參考文獻(xiàn)(References): 11.1臨床檢驗(yàn)管理與技術(shù)規(guī)程.浙江大學(xué)出版 11.2xx州市血站的產(chǎn)前血清學(xué)操作規(guī)程. STANDARD OPERATION PROCEDURE PAGE 7/8 STANDARD OPERATION PROCEDURE PAGE 7/8 K xx州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心 KM-SOP0302019 xx Kingmed Center for Clinical Labrotory Edition 1.0 11.3 WS/T227-2002臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程編寫要求。 11.4xx生物有限公司的試劑說明書。 STANDARD OPERATION PROCEDURE PAGE 8/8 STANDARD OPERATION PROCEDURE PAGE 8/8