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1、一、 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 清理實(shí)驗(yàn)臺(tái)及儀器。 開(kāi)啟冷凍切片機(jī)并將冷凍切片機(jī)預(yù)降至所需溫度（- 15-20 *）。 準(zhǔn)備好處理好的載玻片、刀片、膠水以及藥品。二、 取材 解剖之后迅速取出所需的新鮮組織，用干紗布或?yàn)V紙擦干后不需固定直接取材（24242mm*）,以防形成冰晶造成切片中形成形狀不一的空泡,使細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)移位。（注：取材中目的標(biāo)本既要明確也要確保其結(jié)構(gòu)的完整性，應(yīng)避免不必要的脂肪及壞死組織附著;要盡量剔除毛發(fā)、硬骨或鈣化物;保乳手術(shù)切緣由于脂肪組織較多,取材厚度最好不要超過(guò) 3mm，厚者冰凍費(fèi)時(shí)，大者難以切完整。甲狀腺及淋巴結(jié)組織要帶全組織被膜并除去多余的脂肪組織。）三、冷凍切片1、取出組織支承2、器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺(tái)上冰凍，用吸熱器壓住組織，至包埋劑與組織凍結(jié)成白色冰體即可切片（13分種）。 2、將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機(jī)持承器上，啟動(dòng)粗進(jìn)退鍵，轉(zhuǎn)動(dòng)旋鈕，將組織修平。 3、調(diào)好欲切的厚度，根據(jù)不同的組織而定，原則上是細(xì)胞密集的薄切，纖維多細(xì)胞稀的可稍為厚切，一般在510m間。 4、調(diào)好防卷板。制作冰凍切片，關(guān)鍵在于防卷板的調(diào)節(jié)上，這就要求操作者要細(xì)心，準(zhǔn)確地將其調(diào)較好，調(diào)校至適當(dāng)?shù)奈恢谩Ｇ衅瑫r(shí)，以切出完整、平滑的切片為準(zhǔn)。切好的組織在干凈的玻片上黏附時(shí)順著一個(gè)方向稍微用力輕輕一帶 ,可避免組織攤片過(guò)程中皺折 ,保證組織結(jié)構(gòu)的完整及切片的美觀。注：包埋劑的選3、用：包埋劑是對(duì)冷凍切片質(zhì)量一重要影響因素，包埋劑用量要適宜，過(guò)多或過(guò)少都會(huì)影響標(biāo)本冷凍質(zhì)量。常用的有三種包埋劑OCT劑、B超藕合劑以及普通膠水。B超藕合劑適用于細(xì)胞豐富質(zhì)地較嫩的組織,普通膠水或 OCT劑適用于纖維豐富質(zhì)地偏硬組織。（OCT包埋劑驟冷時(shí)固化，其冷凍速度和軟硬韌度與組織相近，其還具有水溶性，不影響染色等優(yōu)點(diǎn)。）組織塊過(guò)小：先將少量膠擠在托架上預(yù)先放在冰凍機(jī)中冷凍,約30秒鐘左右待膠凝固時(shí)將小組織放上,組織周?chē)偌右恍┠z,再次置于冷凍機(jī)中冷凍,這樣組織被墊高,就能快速切出高質(zhì)量的切片。冷凍箱及冷凍頭的溫度高低，要根據(jù)不同的組織而定。溫度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致組織塊過(guò)硬,切片碎裂,出現(xiàn)梯田狀薄厚4、不均或空洞;反之,溫度過(guò)高,組織塊硬度不夠 ,切片不易成形或成皺褶。數(shù)據(jù)圖1供參考。當(dāng)切片時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)冰凍過(guò)度時(shí)，可將冰凍的組織連同支承器取出來(lái)，在室溫停留片刻，再行切片，或者用口中哈氣，或者用大拇指按壓組織塊，以此來(lái)軟化組織，再行切片。另者，調(diào)高冰凍點(diǎn)。用于附貼切片的載玻片，不能存放于冷凍處，于室溫存放即可。因?yàn)楫?dāng)附貼切片時(shí)，從室溫中取出的載玻片與冷凍箱中的切片有一種溫度差，當(dāng)溫度較高的載玻片附貼上溫度較低的切片時(shí)，由于兩種物質(zhì)間溫度的差別，當(dāng)它們碰撞在一起時(shí)，分子彼此間發(fā)生轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生了一種吸附力，使切片與載玻片牢固地附貼在一起。如果使用冷藏的載玻片來(lái)附貼切片，由于溫度相同，沒(méi)有發(fā)生上述的現(xiàn)5、象。四、 常用冰凍切片蘇木精伊紅染色染色步驟：1、冰凍切片用10%甲醛固定15分鐘，流水沖洗2分鐘，蒸餾水浸洗3分鐘。2、蘇木精12分鐘。自來(lái)水快洗。3、0.5%鹽酸乙醇分色12秒。蒸餾水快洗。4、0.25%0.5%氨水藍(lán)化，幾秒種或至組織變藍(lán)，自來(lái)水洗30秒1分鐘。光鏡下檢查細(xì)胞核分色程度。5、1%伊紅1分鐘。蒸餾水快洗。6、80%、90%、95%乙醇速洗，每級(jí)數(shù)秒到十幾秒。光鏡下監(jiān)控細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)量顏色對(duì)比。7、100%乙醇2次，每次12分鐘。8、二甲苯2次，每次12分鐘。中性樹(shù)膠封固。注：結(jié)束階段的二甲苯作用為透明，其目的是增強(qiáng)標(biāo)本的折光率，達(dá)到光鏡下清晰觀察染色結(jié)果。標(biāo)本內(nèi)若含水分可降6、低其折光率，導(dǎo)致光鏡觀察細(xì)微結(jié)構(gòu)不清楚的結(jié)果。另二甲苯透明后有得于組織細(xì)胞的長(zhǎng)久保存。HE染色的水洗：整個(gè)染色過(guò)程中共5處涉及到水洗，但其洗滌程度及作用均有所不同。 蘇木精染色前的水洗為蒸餾水浸洗：切忌自來(lái)水替代蒸餾水浸洗，否則蘇木精染液由弱酸性（棕紅色）轉(zhuǎn)變?yōu)槿鯄A性（藍(lán)色），導(dǎo)致“有色沉淀”出現(xiàn)與積累，致使染色結(jié)果為黑藍(lán)色。 蘇木精染色后的水洗為自來(lái)水洗，伊紅染色后的水洗為蒸餾水快洗，作用是洗去未與組織相結(jié)合的染料成分，即洗去“浮色”。伊紅染液為水溶性溶液，浸洗時(shí)間長(zhǎng)會(huì)使組織的伊紅顏色減退。 分色后的水洗為自來(lái)水快洗，目的是終止分色液（0.5%鹽酸乙醇）對(duì)組織細(xì)胞的分色作用。過(guò)度分色將致使染7、色強(qiáng)度減弱，影響蘇木精與伊紅顏色的匹配。 藍(lán)化后的水洗為自來(lái)水沖洗，洗掉組織中多余的堿性成分（淡氨水），為伊紅染色提供適宜的染色環(huán)境。五、冰凍切片的快速染色法 切片固定30秒1分鐘。 水洗(10秒)。 染蘇木素35分鐘。自來(lái)水沖洗片刻。（在組織上加蘇木精染液數(shù)滴,放在漂片機(jī)上的烤板上加熱一分鐘。染液不能干）分化(1%酸乙醇分化)。 于堿水(氨水)中返藍(lán)20秒。 伊紅染色1020秒。 脫水，透明，中性樹(shù)膠封固。 注：固定液的選擇A中性福爾馬林溶液 B95%乙醇CAF(40%福爾馬林10ml,95%乙醇90ml)DCarnoy(純乙醇60ml,氯仿30ml,冰醋酸10ml)EClzrke改良液4(8、純乙醇95ml,冰醋酸5ml)FBouin液(飽和苦味酸水溶液75ml,甲醛水溶液 25ml,冰醋酸5ml) 6種固定液固定后的組織切片染色效果各有差異,其中C 固定液固定的切片染色效果最好,組織結(jié)構(gòu)清晰,核染色鮮艷,核無(wú)明顯腫脹,核漿對(duì)比度好,鏡下與石蠟切片相似(圖1)。D 液、E 液、F 液染色效果均較好,結(jié)構(gòu)較清晰, 核染色較鮮艷,但核有腫脹,核輪廓有些模糊。A 液染色效果較差,組織結(jié)構(gòu)尚清楚,但細(xì)胞核腫脹比較明顯且境界模糊不清(圖2)。B 液染色效果差,核著色不良,結(jié)構(gòu)模糊。甲醛、乙醇、冰醋酸、苦味酸對(duì)組織均有固定作用。甲醛對(duì)組織的穿透力強(qiáng),對(duì)組織無(wú)明顯收縮和膨脹作用,但它不能抵消因冷9、凍所引起的細(xì)胞內(nèi)液體的膨脹,所以甲醛固定的組織結(jié)構(gòu)尚完好,核有腫脹、模糊。乙醇對(duì)組織有脫水收縮作用,并可沉淀白蛋白、球蛋白、核蛋白,但后者所產(chǎn)生沉淀可溶解于水,使核著色不良。冰醋酸對(duì)組織有明顯的膨脹作用,加重了冷凍所引起的細(xì)胞內(nèi)液體的膨脹,所以用含有冰醋酸的混合固定液(如D 液、E 液、F 液)固定的組織,核腫脹明顯。F 液中雖然苦味酸對(duì)組織有明顯的收縮作用,但有冰醋酸的存在仍然防止不了細(xì)胞的腫脹。本實(shí)驗(yàn)提示混合固定液對(duì)冷凍切片HE 染色的效果優(yōu)于單純固定液,但最好使用不含有冰醋酸的混合液。因此,推薦冷凍切片做HE 染色時(shí)首選AF 固定液。同時(shí),其具有配制簡(jiǎn)單、使用方便的優(yōu)點(diǎn)。六、 實(shí)驗(yàn)后打掃10、冷凍切片機(jī)使用結(jié)束后關(guān)閉電源,清潔腔體和擦干水氣, 做好使用記錄。 為讓水蒸氣蒸發(fā)，請(qǐng)不要馬上關(guān)閉切片機(jī)的上蓋移門(mén)，待過(guò)段時(shí)間再關(guān)。如需詳細(xì)說(shuō)明，請(qǐng)借閱說(shuō)明書(shū)。七、主要試劑與溶液的配制1、10%甲醛甲醛水溶液（3040%）100mL，蒸餾水900mL。 價(jià)格便宜，對(duì)標(biāo)本浸透快，不會(huì)產(chǎn)生過(guò)硬效果，可作為大標(biāo)本的保存液，每隔3個(gè)月更換新液體，但可產(chǎn)生甲醛色素顆粒。2、10%中性甲醛10%甲醛水溶液1000mL，過(guò)量的碳酸鈣（固體）沉積于底部，pH約為7.6。可避免其色素顆粒的形成。3、Harris蘇木精蘇木精2.5g，純乙醇25mL，硫酸鋁鉀50g，蒸餾水500mL，氧化汞（或碘酸鈉）1.25g，11、冰醋酸20mL。純乙醇溶解蘇木精，然后加入徹底溶解的鉀明礬水溶液。分別加入氧化汞和冰醋酸，充分混合即可使用。冰醋酸的加入可以任意選擇。4、1%伊紅水溶液伊紅Y10g，蒸餾水1000mL。混合，加入幾粒麝香草酚結(jié)晶防止菌類的產(chǎn)生。 若組織細(xì)胞染色后伊紅色度較淺，加入加入0.5mL稀釋的醋酸水溶液到1000mL的伊紅溶液內(nèi)，提高其酸性，增強(qiáng)其色度。染色時(shí)間為15秒10分鐘。細(xì)胞質(zhì)、其內(nèi)的嗜酸性物質(zhì)以及膠原纖維等被染成鮮亮、清晰的紅色或粉紅色。伊紅溶液的最佳染色pH為4.65.0。5、0.5%鹽酸乙醇溶液濃鹽酸0.5mL，70%乙醇100mL。 通常配制0%鹽酸乙醇（70%）儲(chǔ)備液備用，需要時(shí)稀釋即12、可。6、0.5%氫氧化銨水溶液25%氫氧化銨0.5mL，自來(lái)水100mL. 由于氨成分易揮發(fā)，因此應(yīng)隨時(shí)留意溶液中的氨的濃度。石蠟切片的優(yōu)點(diǎn)在于可以容易的存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，一定要存在-80度的低溫冰箱中，尤其是用來(lái)做原位雜交的的切片，為了防止RNA降解，保存 一貫很重要。冰凍切片的優(yōu)點(diǎn)是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫組化時(shí)不需抗原修復(fù)這一步。缺點(diǎn)是切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒(méi)石蠟的漂亮。冰凍切片由于抗原性保存比較好，所以容易出陽(yáng)性結(jié)果，但是組織結(jié)構(gòu)形態(tài)的保存沒(méi)有石蠟切片佳，而且抗原容易彌散，不易觀察抗原分布情況。石蠟切片由于處理的原因，抗原常被封閉甚至破壞，需要抗原修13、復(fù)步驟，而且不一定能修復(fù)成功。表1不同溫度下各種新鮮組織用冷凍切片結(jié)果組織名稱冷凍頭溫度冷凍箱內(nèi)溫度結(jié)果肝腎脾淋巴結(jié)心臟- 10 - 12 - 15 - 20 - 15 - 15 - 20 - 25 無(wú)法成片成片不理想 ,欠挺直切片挺直 ,完整切片出現(xiàn)水平小裂痕消化管(食道 胃 腸管)- 10 - 15 - 20 - 25 - 15 - 20 - 25 - 30 無(wú)法成片成片不理想 ,欠挺真切片挺直 ,完整切片出現(xiàn)水平小裂痕大腦小腦- 15 - 20 - 23 - 30 - 20 - 25 - 28 - 35 無(wú)法成片成片不理想 ,欠挺直切片挺直 ,完整切片出現(xiàn)水平小裂痕腺體(唾液腺 乳腺甲狀腺 前列腺)- 15 - 20 - 25 - 30 - 20 - 25 - 30 - 35 無(wú)法成片成片不理想 ,欠挺直切片挺直 ,完整切片出現(xiàn)水平小裂痕皮 膚- 15 - 20 - 25 - 30 - 20 - 25 - 30 - 35 無(wú)法成片成片不理想 ,欠挺直切片挺直 ,完整切片出現(xiàn)水平小裂痕脂肪組織花生種子- 15 - 25 - 35 - 30 - 20 - 30 - 35 - 40 無(wú)法成片成片不理想 ,欠挺直切片挺直 ,完整切片出現(xiàn)水平小裂痕