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1、721A型分光光度計使用、檢查、實驗、計算作業指導書編 制： 審 核： 批 準： 版 本 號: ESZAQDGF001 編 制： 審 核: 批 準： 發 布： 二XX年X月 721分光光度計的使用光的本質是電磁波。不同的光，有不同的波長。肉眼可見的彩色光稱為可見光，波長范圍在400-750nm，小于400nm的光線為紫外線，大于750nm的光線稱為紅外線。光線通過透明溶液介質時，一部分被吸收，一部分透過，因此光線射出溶液后光波部分減少。這種光波的吸收和透過可用于物質的定性定量分析。吸光分析依據的是Lambert和Beer定律。一、Lambert定律一束單色光通過透明溶液時，一部分的光波被吸收，2、被吸收光波的量與溶液厚度有一定比例關系。I = I0e-al式中I0為入射光強度I為通過溶液后的光強度l為溶液的徑長e為自然對數的底，即2.718a為溶液的吸光率（1）式可改寫為：ln（I0/I）= al(2)將（2）式換算成常用對數式，即log（I0/I）= 0.43al 令K = 0.43a 則log（I0/I）= Kl(3)此處以K為吸光率。二、Beer定律以溶液中溶質濃度變化代替溶液厚度的改變，光波的吸收與溶質濃度的改變有類同的關系。即一束單色光通過溶液時，光波被溶液吸收一部分，吸收多少與溶液中溶質濃度有一定比例關系。依據Lambert定律中同樣的推導，可得出下式。log（I0/I）=3、 KC(4)式中c為溶液中溶質的濃度。Lambertp定律和Beer定律合并，即(3)和(4)式合并為log（I0/I）= KCl(5)令T =（I/I0） A = log（I0/I）則A = KCl(6)式中A為吸光度，T為透光度(6)式為Lembert-Beer定律的物理表示式，其含義為：一束單色光通過溶液后，光波被吸收一部分，吸收多少與溶液中的溶質的濃度和溶液厚度成正比。此式為吸光分析法的基本計算式。三、721A型分光光度計儀器介紹目前科研和臨床最常用的分光光度儀器（可見光區）是721分光光度計。721A型分光光度計采用自準式光路，單光束方法。光譜范圍在360800nm。以鎢絲燈泡為光源4、，經透鏡聚光后射入單色器內，再經棱鏡色散后，反射到準直鏡，穿狹縫得到波長范圍更窄的光波作為入射光，進入比色池透出的光波被光電管接受，產生光電流。經微電流放大器送至對數放大器，由對數放大器變換成常用對數值輸出，再送至濃度調節器，數字面板表面通過切換開關分別選擇微電流放大器的輸出、對數放大器的常用對數輸出及濃度調節器的輸出信號進行透射比（T）、光密度（A）和濃度（C）的顯示。下面分別簡述儀器主要部件，并附“結構示意圖”和“儀器外形圖”。1.光源：以12V25W鹵鎢燈泡為光源。2.單色器組件：包括光縫片（園弧形的兩片）、棱鏡、準直鏡、凸輪、波長盤、入射光與出射光調節部件等。是儀器的主要部件之一。3.5、試樣xx（比色皿）：進光婧統齬餉娼雜曬庋瞥桑約跎俟獾納洌殖置嫖煌腹獾拿壬蟮墓娓裎?SPANlang=EN-US0.5、1、2、3厘米4種。4.受光器：不是光電比色計的光電池而是光電管。它的陰極表面有一層對光靈敏的物質，光照射到光電管后，會發射出光電子，此光電子向陽極運動，形成光電流。光電管的靈敏度雖比光電池小，但經光電管出來的光電流可以放大，而經光電池出來的光電流不易放大，并且光電池易疲乏，故較高級的分光光度計均采用光電管作受光器。5.檢測系統：包括對數放大器，濃度調節器和數字面板顯示表。【實驗準備】一、器材1.擦鏡紙或棉花、濾紙片。2.1厘米的比色皿，鋪有濾紙的表面皿或培養皿。3.220V交6、流電源，外接地線牢固。4、721A型分光光度計，配有儀器布罩。二、試劑1.蒸餾水或空白試劑（B）。2.不同濃度的同種顏色透明溶液兩份，用作標準液（S）及待測液（U）。【實驗操作】1.檢查721A型分光光度計的旋鈕和開關，使其回復零點。2.按要求接通電源，按下“T鍵”，打開暗盒蓋和電源開關，指示燈亮。預熱20分鐘。3.調節波長旋鈕至所需波長。4.取比色皿分別盛裝B、S、U液，置入檢測室（比色皿先用蒸餾水洗后，再用比色液潤洗才能裝比色液）。B液對準光路。5.調節面板“零位細調”，使指示為00.0，即透射比“T”的零點，同時“一”號閃躍。6.合下檢測室蓋.調節“光量粗、細調”電位器，使指示為100.7、0，須反復5、6兩點操作達到穩定。7.按下“A”鍵，指示為“.000”同時“一”閃躍，如果指示讀數不是比值時，應調節“消光調零“電位器，使其達到要求。8.拉出或推入拉桿，使U、S液分別置于光路讀取A值，然后移動拉桿，讀B管A值，如為0，則前述A值有效。9.在穩定時，重復讀數一次，并按下“T”鍵。10.打開檢測室蓋，取出比色皿，傾去比色液于水槽中，用自來水沖洗干凈，倒置于表面皿（鋪有濾紙）中。11.關上電源開關，拔出電源插頭，取出比色皿架，檢查檢測室內是否有液體濺出，并擦凈。檢測室內放入硅膠袋，合上蓋，套上儀器罩。【計算】1.利用標準管計算測定物含量實際測定過程中，用一已知濃度的測定物按測定管同8、樣處理顯色，讀取吸光度，再根據（6）式計算，即A1= K1C1l1 A2= K2C2l2式中A1、A2分別為已知濃度標準和未知濃度測定吸光度。c1、c2分別為已知濃度標準管和未知濃度測定管中測定物濃度。因盛標準液和測定液的比色杯徑長相同（l1=l2），故上二式可寫成：A1/K1C1= A2/K2C2(7)因標準液和測定液中溶質為同一物，K值相同，即：（7）式可換算成下式：C2=（A2/A1）C1(8)因測定液和標準液在處理過程中體積相同，故（8）式可寫成：m2 =（A2/A1）m1(9)式中m1、m2分別表示標準液和測定液中待測物的含量。（9）式為實驗操作中常用計算式。2.利用標準曲線進行換算9、先配制一系列已知不同濃度的測定物溶液，按測定管同樣方法處理顯色，分別讀取各管吸光度，以各管吸光度為縱軸，各管溶液濃度為橫軸，在方格座標紙上作圖得標準曲線。以后進行測定時，就無需再作標準管，以測定管吸光度從標準曲線上可求得測定物的濃度。一般認為，標準曲線范圍在標準管測定物濃度的一半到二倍之間，并使吸光度在0.05-1.0范圍內為宜。所作標準曲線僅供短期使用。標準曲線制作與測定管測定應在同一臺儀器上進行，有時盡管型號相同，操作條件完全一樣，因不是同一臺儀器，其結果會有一定誤差。3.利用摩爾吸光率求測定物濃度(6)式中K為吸光率，當濃度c為1mol/L，溶液厚度L為1cm時，則稱為摩爾吸光率，以表示10、，此時與A相等。實際應用中測定物常以g/ml作濃度單位。已知情況下，讀取測定液徑長為1cm時的吸光度，根據下式可求出測定液的物質濃度。C = A/此計算式常用于紫外吸收法，如蛋白質溶液含量測定，因蛋白質在波長280nm下具有最大吸收峰，利用已知蛋白質在波長280nm時的克分子吸光率，再讀取待測蛋白質溶液的吸光度，即可算出待測蛋白質的濃度，無需顯色，操作簡便。【注意事項】1.儀器須安放在穩固的工作臺上，不能隨意搬動。嚴防震動，潮濕和強光直射。2.盛裝比色液時，約達比色皿體積，不宜過多或過少。若不慎使溶液流至比色皿外面須用棉花或拭鏡紙擦干，才能放入比色架。拉比色桿時要輕，以防溶液濺出，腐蝕機械。311、.千萬不可用手或濾紙等物摩擦比色皿的透光面。4.比色皿用后應立即用自來水沖洗干凈，若不能洗凈，用5%中性皂溶液或洗衣粉溶液浸泡，也可用新鮮配制的重鉻酸鉀洗液短時間浸泡，然后用水沖洗干凈，倒置晾干。5.每套分光光度計上的比色皿和比色皿架不得隨意更換。6.試管或試劑不得放置于儀器上，以防試劑濺出腐蝕機殼。7.如果試劑濺在儀器上，應立即用棉花或紗布擦干。8.測定溶液濃度的光密度值宜在0.10.7之間最符合光吸收定律，線性好，讀數誤差較小。如光密度超過0.11.0范圍，可調節比色液濃度，適當稀釋或加濃，再進行比色。9.合上檢測室蓋連續工作的時間不宜過長，以防光電管疲乏。每次讀完比色架內的一組讀數后，立即打開檢測室蓋。10.儀器連續使用不應超過2小時，必要時間歇半小時再用。11.測定未知液時，先作該溶液的吸收光譜曲線，再選擇最大吸收峰的波長作為測定波長。12.721分光光度計的放大器暗盒及單色器箱處放有兩個硅膠筒，檢測室內放硅膠袋，應經常檢查，發現硅膠變色，應更換新硅膠或烘干再用。13.儀器較長時間不使用，應定期通電、預熱。14.儀器用完之后，須拔去電源，套上儀器罩。