1、一、 實驗前準備 清理實驗臺及儀器。 開啟冷凍切片機并將冷凍切片機預降至所需溫度（- 15-20 *）。 準備好處理好的載玻片、刀片、膠水以及藥品。二、 取材 解剖之后迅速取出所需的新鮮組織，用干紗布或濾紙擦干后不需固定直接取材（24242mm*）,以防形成冰晶造成切片中形成形狀不一的空泡,使細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)移位。（注：取材中目的標本既要明確也要確保其結(jié)構(gòu)的完整性，應避免不必要的脂肪及壞死組織附著;要盡量剔除毛發(fā)、硬骨或鈣化物;保乳手術切緣由于脂肪組織較多,取材厚度最好不要超過 3mm，厚者冰凍費時，大者難以切完整。甲狀腺及淋巴結(jié)組織要帶全組織被膜并除去多余的脂肪組織。）三、冷凍切片1、取出組織支承
2、器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺上冰凍，用吸熱器壓住組織，至包埋劑與組織凍結(jié)成白色冰體即可切片（13分種）。 2、將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機持承器上，啟動粗進退鍵，轉(zhuǎn)動旋鈕，將組織修平。 3、調(diào)好欲切的厚度，根據(jù)不同的組織而定，原則上是細胞密集的薄切，纖維多細胞稀的可稍為厚切，一般在510m間。 4、調(diào)好防卷板。制作冰凍切片，關鍵在于防卷板的調(diào)節(jié)上，這就要求操作者要細心，準確地將其調(diào)較好，調(diào)校至適當?shù)奈恢谩Ｇ衅瑫r，以切出完整、平滑的切片為準。切好的組織在干凈的玻片上黏附時順著一個方向稍微用力輕輕一帶 ,可避免組織攤片過程中皺折 ,保證組織結(jié)構(gòu)的完整及切片的美觀。注：包埋劑的選
3、用：包埋劑是對冷凍切片質(zhì)量一重要影響因素，包埋劑用量要適宜，過多或過少都會影響標本冷凍質(zhì)量。常用的有三種包埋劑OCT劑、B超藕合劑以及普通膠水。B超藕合劑適用于細胞豐富質(zhì)地較嫩的組織,普通膠水或 OCT劑適用于纖維豐富質(zhì)地偏硬組織。（OCT包埋劑驟冷時固化，其冷凍速度和軟硬韌度與組織相近，其還具有水溶性，不影響染色等優(yōu)點。）組織塊過小：先將少量膠擠在托架上預先放在冰凍機中冷凍,約30秒鐘左右待膠凝固時將小組織放上,組織周圍再加一些膠,再次置于冷凍機中冷凍,這樣組織被墊高,就能快速切出高質(zhì)量的切片。冷凍箱及冷凍頭的溫度高低，要根據(jù)不同的組織而定。溫度過低會導致組織塊過硬,切片碎裂,出現(xiàn)梯田狀薄厚
4、不均或空洞;反之,溫度過高,組織塊硬度不夠 ,切片不易成形或成皺褶。數(shù)據(jù)圖1供參考。當切片時，如果發(fā)現(xiàn)冰凍過度時，可將冰凍的組織連同支承器取出來，在室溫停留片刻，再行切片，或者用口中哈氣，或者用大拇指按壓組織塊，以此來軟化組織，再行切片。另者，調(diào)高冰凍點。用于附貼切片的載玻片，不能存放于冷凍處，于室溫存放即可。因為當附貼切片時，從室溫中取出的載玻片與冷凍箱中的切片有一種溫度差，當溫度較高的載玻片附貼上溫度較低的切片時，由于兩種物質(zhì)間溫度的差別，當它們碰撞在一起時，分子彼此間發(fā)生轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生了一種吸附力，使切片與載玻片牢固地附貼在一起。如果使用冷藏的載玻片來附貼切片，由于溫度相同，沒有發(fā)生上述的現(xiàn)
5、象。四、 常用冰凍切片蘇木精伊紅染色染色步驟：1、冰凍切片用10%甲醛固定15分鐘，流水沖洗2分鐘，蒸餾水浸洗3分鐘。2、蘇木精12分鐘。自來水快洗。3、0.5%鹽酸乙醇分色12秒。蒸餾水快洗。4、0.25%0.5%氨水藍化，幾秒種或至組織變藍，自來水洗30秒1分鐘。光鏡下檢查細胞核分色程度。5、1%伊紅1分鐘。蒸餾水快洗。6、80%、90%、95%乙醇速洗，每級數(shù)秒到十幾秒。光鏡下監(jiān)控細胞核與細胞質(zhì)量顏色對比。7、100%乙醇2次，每次12分鐘。8、二甲苯2次，每次12分鐘。中性樹膠封固。注：結(jié)束階段的二甲苯作用為透明，其目的是增強標本的折光率，達到光鏡下清晰觀察染色結(jié)果。標本內(nèi)若含水分可降
6、低其折光率，導致光鏡觀察細微結(jié)構(gòu)不清楚的結(jié)果。另二甲苯透明后有得于組織細胞的長久保存。HE染色的水洗：整個染色過程中共5處涉及到水洗，但其洗滌程度及作用均有所不同。 蘇木精染色前的水洗為蒸餾水浸洗：切忌自來水替代蒸餾水浸洗，否則蘇木精染液由弱酸性（棕紅色）轉(zhuǎn)變?yōu)槿鯄A性（藍色），導致“有色沉淀”出現(xiàn)與積累，致使染色結(jié)果為黑藍色。 蘇木精染色后的水洗為自來水洗，伊紅染色后的水洗為蒸餾水快洗，作用是洗去未與組織相結(jié)合的染料成分，即洗去“浮色”。伊紅染液為水溶性溶液，浸洗時間長會使組織的伊紅顏色減退。 分色后的水洗為自來水快洗，目的是終止分色液（0.5%鹽酸乙醇）對組織細胞的分色作用。過度分色將致使染
7、色強度減弱，影響蘇木精與伊紅顏色的匹配。 藍化后的水洗為自來水沖洗，洗掉組織中多余的堿性成分（淡氨水），為伊紅染色提供適宜的染色環(huán)境。五、冰凍切片的快速染色法 切片固定30秒1分鐘。 水洗(10秒)。 染蘇木素35分鐘。自來水沖洗片刻。（在組織上加蘇木精染液數(shù)滴,放在漂片機上的烤板上加熱一分鐘。染液不能干）分化(1%酸乙醇分化)。 于堿水(氨水)中返藍20秒。 伊紅染色1020秒。 脫水，透明，中性樹膠封固。 注：固定液的選擇A中性福爾馬林溶液 B95%乙醇CAF(40%福爾馬林10ml,95%乙醇90ml)DCarnoy(純乙醇60ml,氯仿30ml,冰醋酸10ml)EClzrke改良液4(
8、純乙醇95ml,冰醋酸5ml)FBouin液(飽和苦味酸水溶液75ml,甲醛水溶液 25ml,冰醋酸5ml) 6種固定液固定后的組織切片染色效果各有差異,其中C 固定液固定的切片染色效果最好,組織結(jié)構(gòu)清晰,核染色鮮艷,核無明顯腫脹,核漿對比度好,鏡下與石蠟切片相似(圖1)。D 液、E 液、F 液染色效果均較好,結(jié)構(gòu)較清晰, 核染色較鮮艷,但核有腫脹,核輪廓有些模糊。A 液染色效果較差,組織結(jié)構(gòu)尚清楚,但細胞核腫脹比較明顯且境界模糊不清(圖2)。B 液染色效果差,核著色不良,結(jié)構(gòu)模糊。甲醛、乙醇、冰醋酸、苦味酸對組織均有固定作用。甲醛對組織的穿透力強,對組織無明顯收縮和膨脹作用,但它不能抵消因冷
9、凍所引起的細胞內(nèi)液體的膨脹,所以甲醛固定的組織結(jié)構(gòu)尚完好,核有腫脹、模糊。乙醇對組織有脫水收縮作用,并可沉淀白蛋白、球蛋白、核蛋白,但后者所產(chǎn)生沉淀可溶解于水,使核著色不良。冰醋酸對組織有明顯的膨脹作用,加重了冷凍所引起的細胞內(nèi)液體的膨脹,所以用含有冰醋酸的混合固定液(如D 液、E 液、F 液)固定的組織,核腫脹明顯。F 液中雖然苦味酸對組織有明顯的收縮作用,但有冰醋酸的存在仍然防止不了細胞的腫脹。本實驗提示混合固定液對冷凍切片HE 染色的效果優(yōu)于單純固定液,但最好使用不含有冰醋酸的混合液。因此,推薦冷凍切片做HE 染色時首選AF 固定液。同時,其具有配制簡單、使用方便的優(yōu)點。六、 實驗后打掃
10、冷凍切片機使用結(jié)束后關閉電源,清潔腔體和擦干水氣, 做好使用記錄。 為讓水蒸氣蒸發(fā)，請不要馬上關閉切片機的上蓋移門，待過段時間再關。如需詳細說明，請借閱說明書。七、主要試劑與溶液的配制1、10%甲醛甲醛水溶液（3040%）100mL，蒸餾水900mL。 價格便宜，對標本浸透快，不會產(chǎn)生過硬效果，可作為大標本的保存液，每隔3個月更換新液體，但可產(chǎn)生甲醛色素顆粒。2、10%中性甲醛10%甲醛水溶液1000mL，過量的碳酸鈣（固體）沉積于底部，pH約為7.6。可避免其色素顆粒的形成。3、Harris蘇木精蘇木精2.5g，純乙醇25mL，硫酸鋁鉀50g，蒸餾水500mL，氧化汞（或碘酸鈉）1.25g，
11、冰醋酸20mL。純乙醇溶解蘇木精，然后加入徹底溶解的鉀明礬水溶液。分別加入氧化汞和冰醋酸，充分混合即可使用。冰醋酸的加入可以任意選擇。4、1%伊紅水溶液伊紅Y10g，蒸餾水1000mL。混合，加入幾粒麝香草酚結(jié)晶防止菌類的產(chǎn)生。 若組織細胞染色后伊紅色度較淺，加入加入0.5mL稀釋的醋酸水溶液到1000mL的伊紅溶液內(nèi)，提高其酸性，增強其色度。染色時間為15秒10分鐘。細胞質(zhì)、其內(nèi)的嗜酸性物質(zhì)以及膠原纖維等被染成鮮亮、清晰的紅色或粉紅色。伊紅溶液的最佳染色pH為4.65.0。5、0.5%鹽酸乙醇溶液濃鹽酸0.5mL，70%乙醇100mL。 通常配制0%鹽酸乙醇（70%）儲備液備用，需要時稀釋即
12、可。6、0.5%氫氧化銨水溶液25%氫氧化銨0.5mL，自來水100mL. 由于氨成分易揮發(fā)，因此應隨時留意溶液中的氨的濃度。石蠟切片的優(yōu)點在于可以容易的存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，一定要存在-80度的低溫冰箱中，尤其是用來做原位雜交的的切片，為了防止RNA降解，保存 一貫很重要。冰凍切片的優(yōu)點是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫組化時不需抗原修復這一步。缺點是切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的漂亮。冰凍切片由于抗原性保存比較好，所以容易出陽性結(jié)果，但是組織結(jié)構(gòu)形態(tài)的保存沒有石蠟切片佳，而且抗原容易彌散，不易觀察抗原分布情況。石蠟切片由于處理的原因，抗原常被封閉甚至破壞，需要抗原修
13、復步驟，而且不一定能修復成功。表1不同溫度下各種新鮮組織用冷凍切片結(jié)果組織名稱冷凍頭溫度冷凍箱內(nèi)溫度結(jié)果肝腎脾淋巴結(jié)心臟- 10 - 12 - 15 - 20 - 15 - 15 - 20 - 25 無法成片成片不理想 ,欠挺直切片挺直 ,完整切片出現(xiàn)水平小裂痕消化管(食道 胃 腸管)- 10 - 15 - 20 - 25 - 15 - 20 - 25 - 30 無法成片成片不理想 ,欠挺真切片挺直 ,完整切片出現(xiàn)水平小裂痕大腦小腦- 15 - 20 - 23 - 30 - 20 - 25 - 28 - 35 無法成片成片不理想 ,欠挺直切片挺直 ,完整切片出現(xiàn)水平小裂痕腺體(唾液腺 乳腺甲狀腺 前列腺)- 15 - 20 - 25 - 30 - 20 - 25 - 30 - 35 無法成片成片不理想 ,欠挺直切片挺直 ,完整切片出現(xiàn)水平小裂痕皮 膚- 15 - 20 - 25 - 30 - 20 - 25 - 30 - 35 無法成片成片不理想 ,欠挺直切片挺直 ,完整切片出現(xiàn)水平小裂痕脂肪組織花生種子- 15 - 25 - 35 - 30 - 20 - 30 - 35 - 40 無法成片成片不理想 ,欠挺直切片挺直 ,完整切片出現(xiàn)水平小裂痕
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